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化學發光底物的原理與用途
  • 發布日期:2022-08-01      瀏覽次數:1643
    •        辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化并發光,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中,將復雜的蛋白混合物經sds-page分離,并轉移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用于免疫學檢測,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應。

       原理

       辣根過氧化酶使試劑中的發光物(luminol)氧化并發光,而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中,將復雜的蛋白混合物經sds-page分離,并轉移到固相膜上(如nc、pvdf)等,用于免疫學檢測,經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接(標記一抗)或間接(標記二抗)反應。當加入免疫印跡化學發光試劑后,luminol發生氧化降解,并發射波長為428nm的光,此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

      用途

      非放射性發光系統,用于檢測固定在膜上的蛋白,其敏感性達1-5pg。用x光片可快速地獲得永.久的硬拷貝結果。所含獨.特的底物足以維持12小時以上的發光,便于反復曝光操作,免疫印跡膜經抗體脫卸處理后可供再次抗體探查使用。適用于痕量蛋白或核酸檢測。

      使用方法

      1. 印跡膜制備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作,適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP,一般采用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對于降低背景非常重要,在與HRP交聯物溫育后,膜片更需仔細洗滌,所有步驟均在室溫下完成。

      2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液,混合后盡快使用。將膜片置混合液中于室溫下振蕩溫育2分鐘,每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
      3.蛋白信號顯現
      1). 用平頭鑷鉗住膜片,垂直置于吸水紙以吸去過量試劑。
      2). 置膜片于二層保鮮膜之間,小心趕盡氣泡。
      3). 將膜片吸附蛋白面朝上,置于x光片盒中。
      4). 于暗室中壓上x光片。
      5).根據信號的強弱適當調整曝光時間,一般為1min或5min,也可選擇不同時間多次壓片,以達最佳效果。顯影沖洗。
      6). 調節曝光時間,再次曝光顯影。
      4、膜的重復使用:
      配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液,膜放入后,70?c振蕩水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩沖液洗脫,最后用bsa(牛血清白蛋白)或牛奶封閉。


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