試劑盒產地：比利時Bio-X
1. 檢測原理 8. 工作液的準備
2. 操作時間 9. 樣品前處理
3. 檢測下限 10. 酶聯免疫實驗設計
4. 回收率 11. 操作步驟
5. 交叉反應率 12. 結果計算
6. 試劑盒的組成 13. 結果分析
7．需要設備及試劑 14.注意事項
簡介：
克倫特羅（Clenbuterol）屬于beta興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對非條紋肌肉組織的松弛作用。進年來被一些人非法添加到飼料中以提高脂肪型動物的瘦肉率和加速動物的生長。當用作生長調節劑時，其添加量是治療量的5—10倍，常在動物體內殘留而給消費者帶來危害。
通常，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測的確證方法，但是其前處理步驟費用昂貴，而ELISA快速檢測試劑盒因成本低、操作簡便、速度快、一次檢測樣本量大、儀器化低，現已成為常規的篩選方法。
1.檢測原理：
測定的基礎是抗原抗體反應。微孔板上包被有針對兔IgG（Clenbuterol抗體）的羊抗體，含有克倫特羅抗原的樣品或標準品與酶標記物被加入到小孔中，經過孵育及洗滌步驟后，游離的抗原與抗原酶標記物競爭抗體結合位點，沒有結合的抗原酶標記物在清洗步驟中被除去，將顯色液加入到孔中并且孵育，結合的酶標記物將無色的發色劑轉化為藍色的產物。加入反應停止液后使顏色由藍色轉為黃色。在450nm處測量，吸光強度與樣品的克倫特羅濃度成反比。
2.操作時間：1小時（30分鐘孵育+30分鐘顯色）
3.檢測下限：0.1ppb
4.回收率：
尿樣和血清： 97-110%
飼料： 95-100%
肝臟/組織： 90-97%
牛奶及奶粉 100%
5.交叉反應率：
Clenbuterol （克倫特羅） 100%
Mabuterol（馬普特羅） 100%
Mapenterol（馬噴特羅） 100%
Salbutamal （沙丁胺醇） 8-9%
Terbutalin （特普他林） 7-8%
Simarterol（塞曼特羅） <0.1%
Isoproterenol（異丙腎上腺素） <0.1%
Fenoterol（非諾特羅） <0.1%
6.試劑盒的組成：
1） 96孔酶標板：12條╳8孔（包被有抗兔IgG）.
2） 克倫特羅標準液6瓶：1ml /瓶，為Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.
3）酶聯結合物Conjugate peroxidase： 6ml 黃蓋
4） 抗Clenbuterol抗體溶液：Anti-clenbuterol antibody 11ml 紅蓋
5） 沖洗液（需10倍稀釋）Wash buffer： 50ml 塑料瓶
6） 檸檬酸鹽緩沖液Citrate buffer： 25ml 藍蓋
7）底物溶液Chromogen： 3 ml 黑蓋
8）樣品稀釋液（需20倍稀釋）Diluent solution: 10ml 綠蓋
9）反應終止液Stop solution： 6ml 白蓋
7.需要設備及試劑（試劑盒中未提供）
設備：
1） 均質器
2） 振蕩器
3） 微孔酶標儀（450nm）
4） 離心機
5） 20ul，50ul，100ul，200ul微量加樣器
6） 免疫親和柱（每根柱子可以至少可以純化120-150個樣本，也可以用C18柱純化）。
試劑：
1） *
2） 0.01M HCL
3） 5M鹽酸
4） 蒸餾水
8.工作液的準備：
1） 洗液：用蒸餾水按（1+9）稀釋
2） 樣品稀釋液：將樣品稀釋液用蒸餾水按（1+19）稀釋（注：在使用前再配）。
3） 底物溶液：用檸檬酸緩沖液（1+9）稀釋（注：檸檬酸緩沖液本試劑盒內有提供，稀釋后的溶液避免光線直射）。
注：終止液含硫酸，要小心操作。
9.樣品前處理：
9.1尿液和血清：（稀釋因子1）
尿液和血清不用處理，直接測定。（如果尿液渾濁，一定要過濾或離心）
9.2肝臟
9.2.1（簡便前處理方法）（稀釋因子3）
1） 取1g肝臟樣品，加入2ml0.01M HCL.
2） 均質5分鐘.
3） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調節.
4） 離心15分鐘3500rpm，或者離心5分鐘13000rpm，轉移出上清液備用.
9.2.2.（復雜前處理方法）（稀釋因子1）
1） 帶有低脂肪的肝，肉或組織.
2） 5g粉碎的樣品于25ml 50mM 鹽酸混合，振蕩15分鐘，以達到均質的目的。
3） 稱6g均質物（相當于1g肝臟），加入離心瓶中。
4） 10—15℃離心15分鐘4000rpm或更高的轉速。
5） 轉移出上清液至另一個離心瓶中，加300ul 1M *混合15分鐘。
6） 加入4ml 500mM 磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡單混合并在4℃保存至少1.5小時或過夜
7） 在10-15℃離心15分鐘，4000g或更高轉速。
8） 分離全部上清液（應該是清亮的），使其升至室溫（20-24℃），然后用C18柱純化（見C18柱純化步驟）。
C18柱純化方法：
所有試劑和樣品處理必須在室溫下（20-24℃）并嚴格控制過柱時的流速。（非常關鍵）
1） 用3ml100%甲醇洗滌柱子，流速為1滴/秒。
2） 用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
3） 樣品進柱。
4） 用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
5） 用正壓去除殘留的液體并用空氣或氮氣吹2分鐘干燥柱子。
6） 用1ml100%甲醇洗脫樣品，流速為15滴/分鐘。
7） 在50-60℃弱空氣或氮氣流下*蒸發溶劑。
8） 用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，備用分析。
9.3飼料（稀釋因子10）：
1） 用乳缽研碎飼料，稱1g研碎的飼料樣品加入10ml0.01M的鹽酸，充分混合5分鐘。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調節
3） 離心5分鐘3500rpm，轉移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾）
4） 直接取上清液進行檢測
9.4牛奶和奶粉（稀釋因子50）：
1） 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml試管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸餾水
2） 加100ul 5M的鹽酸（調節PH至3）
3） 升溫至40℃3-5分鐘直至牛奶凝化，離心5分鐘3500rpm
4） 加5M*100ul，加入46.8ml蒸餾水，用*或鹽酸調節pH值為6.5-8之間
5） 離心15分鐘3500rpm，取上清液進行檢測
9.5組織樣品（稀釋因子50）：
1）1g粉碎的樣品于50ml 試管，加50ml 0.01M HCL混合，振蕩5分鐘，以達到均質的目的。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用*或鹽酸調節
3） 離心5分鐘3500rpm，轉移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉速或用濾紙過濾）
4） 直接取上清液進行檢測
10.酶聯免疫實驗設計：
1） 將所有試劑升至室溫20-25℃，一旦開始實驗，一定要連續不間斷。
2） 所有標準液和待測樣為減少操作誤差，同時做平行實驗。
3）檢測樣品建議做平行實驗（可以減少實驗過程中因操作失誤而影響實驗結果）。
11.操作步驟：（孵育時間30分鐘）
1） 按照所要進行測驗的微孔板條，從酶標板中取出所需的微孔板條并插入框架內。
2） 吸取50ul的蒸餾水作為0標樣。
3） 吸取50ul標準液和待測樣品入各自的微孔內。
4） 每孔內加入50ul酶聯結合物，然后再加入100ul 克倫特羅抗體溶液（該反應速度快，建議使用多道移液器）。
5） 輕輕敲擊微孔板四周，室溫20-25℃避光孵育30分鐘。
6） 傾空微孔板，用250ul沖洗液重復洗板5次，zui后，用力在吸水紙上將殘余液滴拍干（洗板時，標準清洗液注滿微孔，翻轉微孔板傾空，盡量擠壓微孔板，以防微孔板從框架上脫落）。
7） 顯色：每孔加200 ul顯色液，室溫20-25℃避光孵育30分鐘（顯色液用1體積底物溶液+9體積檸檬酸緩沖液） 8） 孵育結束時，每孔加50ul反應終止液，充分混合，在450nm下讀數。
12.結果計算：
1） 樣品中未知的Clenbuterol通過曲線定量計算
2） 將得到的樣品吸光度值減去所有空白值的平均值，計算標準液吸光值和樣品吸光度值以及zui大吸光度值
3） 用樣品或標準液吸光度值（B）除以zui大吸光度值（B0）再乘以100，zui大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率：
根據B/B0的值做出每一個標準樣品的半對數曲線，相對應每一個樣品的濃度就可從曲線上讀出。
13.結果分析：
由于樣品在反應中經過了預先稀釋，因此根據標準曲線所得出的待測樣濃度一定要再乘以其稀釋因子才能得出其在樣品中的正確含量。（尿液和血清的稀釋因子是1，肝臟的稀釋因子是3，飼料的稀釋因子是10，組織的稀釋因子是50，牛奶和奶粉的稀釋因子是50）
14.注意事項：
1） 溫度低于20℃或試劑及標品沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的值偏低。
2） 洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象，所以洗板排干后應立即進行下一步操作。
3） 標準物質和顯色液對光敏感，避免直接暴露在光線下。
4） 混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標準液的時候都必需充分混合均勻）。
5） 反應停止液為強酸性物質，避免接觸皮膚。
6） 不要使用過了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產廠家的試劑盒這樣回引起靈敏度降低。
試劑盒的儲存條件是2-8℃，不要冷凍。
